Frazionamento in base alla solubilità - salting out

Frazionamento in base alla solubilità

Le proteine possono essere frazionate, sulla base della loro solubilità, in diverse condizionni fisiologiche ( variazioni di pH= precipitazione al punto isoelettrico; variazioni della Temperatura= denaturazione al calore che comporta una perdita di solubilità che può generare precipitazione; variazioni della forza ionica= precipitazione frazionata con sali, aumentando la concentrazione salina possiamo far perdere solubilità ad alcune proteine)

La prima tecnica usata in molti protocolli è la precipitazione frazionata con i sali.

salting in: a bassa forza ionica ( I ) ,bassa concentrazione del sale, aumenta la solubilità della proteina

salting out: perdita di solubilità per aumento delle cariche presenti, alcune proteine precipitano a causa della competizione tra gli ioni del sale e le proteine per le molecole di acqua di idratazione.

Le proteine con pozioni superficiali idrofobiche avranno il loro strato di idratazione ma con interazioni più deboli, perciò sono le prime a perdere il guscio di idratazione in favore degli ioni salini. Le porzioni idrofobiche possono interagire tra loro e formare aggregati che precipitano.

Ma quale sale sarà più vantaggioso usare?

Il Solfato d’ammonio viene preferito perchè:

• è molto solubile ( 3.9 M => quindi raggiunge elevate forze ioniche )
• è disponibile ad elevato grado di purezza
• non ha effetti dannosi sulla struttura delle proteine
• la precipitazione è reversibile
• presenta uno ione bivalente ( --> quindi più forza ionica rispetto a un monovalente)

Come procedere?

Si aumenta la forza ionica gradualmente per precipitare in tempi diversi le diverse proteine della miscela.

1. Si aggiunge sale alla soluzone mantenendola in agitazione fino a raggiungere la saturazione desiderata, questo per omogenare la soluzione e non creare dislivelli di concentrazione che porterebbero a precipitazioni indesiderate.

2. Si centrifuga i campione per separare le proteine che hanno effettuato il salting-out dalle altre, separo il pellet dalle proteine in soluzione. Usiamo una centifuga, le provette vanno messe nel rotore che ruoterà rispetto ad un albero centrale. Il supernatante è la parte della soluzione con le molecole solubilizzate.

3. Localizzare la proteina di nostro interesse tramite una tecnica analitica

solubilità in forma logaritmica

Ciacuna retta indica una proteina durante il salting out ( solo la parte finale del grafico di solubilità ), possiamo vederechiaramente che le proteine che precipiteranno prima o dopo a seconda della forza ionica.

Una proteina con un maggior numero di regioni idrofobiche precipita a forza ionica più bassa rispetto ad una con meno ragioni idrofobiche. Per ciascuna proteina c’è una quantità diversa di sale da usare per fare il salting-out. Per questo usiamo la precipitazione frazionata ovvero procediamo per aggiunte successive di sale.

La quantità di sale da aggiungere si esprime come saturazione percentuale, per poter sapere che saturazione utilizzare è necessario fare delle prove sperimentali in provetta prima di procedere.

salting in/out - VIDEO

Dopo il frazionamento con il solfato d’ammonio è in genere necessario rimuovere i sali in eccesso. Per volumi medio-piccoli, da 0.5 a 20 ml si può usare la cromatografia per gel filtrazione mentre per volumi più grandi è conveniente usare la Dialisi.

Dialisi: il campione viene posto in un sacchetto da dialisicostituito da una membrana semipermeabile che permette la libera diffusione di tutte le molecole più piccole (quindi va bene per i nostri ioni in soluzione) ma non delle proteine.

Il sacchetto viene immerso in un recipiente contenente un abbondante volume di tampone mantenendo in agitazione a 4°C.

La concentrazione del sale si ridurrà in quanto tenderà ad equagliarsi tra interno ed esterno del sacchetto, ma all’interno c’è un volume molto più piccolo perciò alla fine la maggior parte del sale si troverà all’esterno del sacchetto.

Ci sono anche sali detti agenti caotropici, questi, aumentano la solubilità denaturando le proteine e sono per eesempio il cloruro di guanidinio e il perclorato di litio.

Vantaggi precipitazione frazionata con sali:

• presenta alta capacità ovvero è in grado di lavorare con grossi volumi di campione
• riduzione di volume in caso di utilizzo del pellet
• allontanamento di contaminanti

Svantaggi:

• bassa risoluzione, non è possibile allontanare tutte le proteine dal nostro target (per migliorarla si potrebbe abbinare il gradiente a un determinato pH)

Precipitazione con solventi organici

Sfrutta la diversa solubilità delle proteine in soluzioni miste di H2O/ solvente organico che può essereetanolo, acetone, butanolo. Il solvente abbassa la costante dielettrica del mezzo favorendoone le interazioni idrostatiche tra le proteine che quindi precipitano.

purtroppo si ha in genere un certo grado di denaturazione.