Purificazione Proteine

Da questo momento in poi tratterò le tecniche più comuni di purificazione di proteine, questa è solo un'introduzione ma giorno per giorno aggiungerò materiale.

Genoma --> Proteoma

Un genoma è l’insieme di geni di un organismo vivente, a questo corrisponde un proteoma che è l’insieme di proteine di un organismo vivente. Conoscendo il genoma solo teoricamente possiamo ipotizzare quali proteine dovrebbero essere presenti infatti non possiamo stabilire:

• quali specifiche proteine sono presenti in ogni specifico tessuto
• se subiscono modificazioni post-traduzionali
• quale sia la loro funzione

Perciò è necessario analizzare il proteoma per avere maggiori informazioni su possibili target molecolari, possibili attività e così via permettendoci di progettare farmaci o mettere appunto terapie.

Non ci sono due proteine con la stessa struttura primaria, perciò, è importante conoscerla perchè attraverso questa possiamo risalire anche alla struttura secondaria, terziaria e quaternaria.

Alterazioni della struttura primaria portano a patologie molecolari ( ex. emoglobina falciforme nella posizione 6 della catena Beta, un residuo di acido glutammico è sostituito da un residuo di valina), la variazioni della struttura primaria hanno parte nell’evoluzione. *

*per avere chiarimenti su questa affermazione vedi ’gli errori di Darwin’ di Piattelli-Palmarini-Fodor

è difficile purificare una proteina?

In generale la proteina che vogliamo individuare e analizzare è presente in piccola quantità, dallo 0.001% al 10%, è opportuno quindi scegliere attentamente la fonte del campione.

La rimozione della proteina dal suo ambiente naturale aumenta la possibilità di denaturazione perchè le condizioni non sono più identiche a quelle in vivo, perciò è necessario ricorreread agenti antiossidanti e operare a 4°C, esistono delle celle frigorifere nelle quali si opera per lavorare a temperatura termostatata.

Ogni proteina è un caso a se, non esiste una strategia universale, il protocollo di purificazione è un’insieme di tecniche di separazione che devono sfruttare principi diversi in modo da allontanare proteine contaminanti diverse.

Tecniche di separazione

Esistono due tipi diversi di tecniche di separazione le quali hanno finalità differenti:

• T. di separazione di tipo preparativo, lo scopo è isolare e recuperare i singoli analiti della miscela per effettuare analisi successive ex. tecniche cromatografiche
• T. di separazione di tipo analitico, l’obbiettivo è identificare e quantificare gli analiti presenti nella miscela, gli analiti non vengono recuperati al termine della separazione. ex. Tecniche elettroforetiche

Protocollo di purificazione

Insieme di tecniche di separazione di tipo preparativo, queste sfruttano diverse proprietà dell’analita:

• solubilità
• massa molecolare
• carica elettrica
• proprietà di adsorbimento
• affinità di legame con altre biomolecole ( ex. enzima substrato )

Chiaramente per convenienza si inizia un protocollo usando tecniche più grossolane (ed economiche) che possano scremare il campione eliminando analiti con proprietà molto differenti, successivamente sarà necessario ricorrere a tecnche sempre più specifiche per poter isolare l’analita cercato.