Tecniche cromatografiche

Le tecniche cromatografiche sono tecniche di separazione dei componenti di una miscela basate sulla diversa distribuzione (ripartizione) dei componenti della miscela tra due fasi immiscibili tra loro: la fase mobile e la fase stazionaria. La fase mobile viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria.

Il fondamento di tutte le tecniche è il Kr, il coefficiente di ripartizione, questo definisce le proporzioni in cui una sostanza si distribuisce tra le due fasi immiscibili. Ogni sostanza ha un caratteristico Kr che la identifica in modo univoco.

Kr= concetrazione fase stazionaria/ concentrazione fase mobile

L’efficienza di una colonna si quantifica con il numero di piatti teorici: il più piccolo volume all’interno della colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e fase stazionaria ovvero il più piccolo volume nel quale si instaura una ripartizione.

La separazione di sostanze diverse tramite il passaggio di fase mobile attraverso una fase stazionaria è detto eluizione.

Abbiamo 4 principali parametri in cromatografia:

• tempo di ritenzione: tempo che intercorre dall’introduzione del campione in colonna all’uscita dello stesso, corrisponde all’apice del picco di eluizione corrispondente alla sostanza.
• tempo morto: tempo che una molecola no ntrattenuta impiega per uscire dalla colonna
• tempo netto di ritenzione: differenza tra tempo di ritenzione e tempo morto
• larghezza dei picchi

La bontà di un sistema cromatografico dipende da:

• selettività, ovvero la capacità di discriminare tra due composti strutturalmente correlati (rapporto tra tempi di ritenzione)
• efficienza, misura degli effetti di diffuzione che provocano l’allargamento dei picchi e la loro sovrapposizione
• capacità, misura della quantità di materiali che può essere risolto senza sovrapposizione dei picchi

Adesso ci concentreremo sulla cromatografia liquida, di questa abbiamo due famiglie:

• Cromatografia su strato sottile (su carta): si usa in modalità analitica, si provoca la separazione delle sostanze su una fase stazionaria che è un foglio di carta, la fase mobile sono dei solventi organici, è poco usata in fase preparativa perchè causa la denaturazione delle proteine però ci da informazioni per esempio sulla purezza del nostro preparato.
• Cromatografia su colonna: si effettua in modalità preparativa e solo in casi particolari può essere usata a scopo analitico, può essere utile a determinare il punto isoelettrico. A differenza dell’HPLC utilizza basse pressioni.

Vediamo come è fatta una colonna per cromatografia liquida:

Tipicamente il reservoir e la colonna sono collegati da una pompa peristaltica per regolare il flusso nel tempo.

L’eluato viene raccolto in contenitori diversi, per non stare a seguire la colonna per tutto il tempo utilizziamo un robottino raccoglitore di frazioni.

Ogni analita (A) sarà presente nel’eluato in un certo momento, analiti diversi possono effluire anche con tempi uguali. Ciascuno però sarà caratterizzato da un proprio coeffiente di distribuzione Kd e coefficiente di ripartizione Kr.

Kd= [A]nella fase stazionaria/[A]nella fase mobile

Abbiamo 3 possibili casi:

• Se Kd=1 allora le concentrazioni nelle due fasi sono uguali [A]mob = [A]staz
• Se Kd>1 allora la [A]staz >[A]mob e quindi l’analita interagisce più facilmente con la fase stazionaria, perciò si muoverà più lentamente perchè ha meno affinità col flusso mobile
• Se Kd<1 allora [A]mob > [A]staz perciò l’analita si muoverà più velocemente

Possiamo misurare la concentrazione dell’analita nelle diverse soluzioni tramite l’assorbimento della luce. Vedremo l’argomento meglio più avanti però in generale possiamo dire che:

1. Troviamo l’Assorbimento

2. Dall’assorbimento troviamo la concentrazione secondo la legge di Lambert-Beer

A= Ɛƛ l c

dove l = cammino ottico, c è la concentrazione e Ɛƛ è una costante che dipende dalla lunghezza d’onda e dalla sostanza che stiamo utilizzando.

Dobbiamo scegliere la lunghezza d’onda adeguata, di solito si sceglie 280 nm perchè nel campo UV a questa lunghezza d’onda sono sensibili tutti i composti aromatici a causa dei doppi legami coniugati e siccome stiamo analizzando proteine è praticamente sicuro siano presenti residui amminoacidici aromatici nella struttura.

Per misurare l’assorbimento possiamo usare un fotometro UV che legge l’assorbimento dell’eluato e lo memorizza in un recorder, l’eluato poi viene raccolto frazionato, lo strumento non presenta una cuvetta classica, è particolare perchè deve misurare l’assorbimento istante per istante in un liquido che cambia, possiede una cella a flusso.

Fase stazionaria

Per la realizzazione della fase stazionaria è molto importante la scelta della matrice poichè questa è il suo supporto, la matrice + gruppi funzionali costituiscono la fase stazionaria. Modificando la matrice inserendo specifici gruppi funzionali otteniamo la fase stazionaria.

Le matrici devono essere stabili dal punto di vista meccanico e permettere flussi elevati di fase mobile, devono essere stabili da un punto di vista chimico senza reagire con la fase mobile o con gli analiti. Ovviamente vogliamo siano insolubili nella fase mobile e nel campione e i gruppi funzionali devono essere opportuni per legare i gruppi funzionali per costituire la fase stazionaria. Infine sarebbe opportuna un’elevata densità di gruppi funzionali per ottenere un’elevata capacità.

Tipi di matrice:

• inorganiche in silice (usate sopratutto per HPLC)
• Polisaccaridiche in cellulosa, destrano, agarosio
• Polimeri organici sintetic come l’acrilamide e il polistirene

Fasi operative di una separazione cromatografica:

1. Impaccamento della colonna
2. Caricamento del campione
3. Eluizione
4. Rivelazione analiti
5. Raccolta delle frazioni
6. Controllo della purificazione

Impaccamento della colonna

E’ il riempimento della colonna con la fase stazionaria, bisogna stare attenti ad equilibrarla opportunamente:

• se la possiediamo in forma di polvere è necessario sospenderla nella fase mobile, in genere acquosa e a pH controllato
• se è già in sospensione in una miscela di acqua/solvente organico (di solito etanolo, si usano solventi organici per conservare a lungo termine) bisogna cambiare la soluzione nella quale è sospesa.

La sospensione deve essere versata nella colonna in continuità e delicatamenteper evitare di formare bolle d’aria,inoltre bisogna tenere chiuso il rubinetto. Poi apriamo il rubinetto per far scendere la fase mobile in eccesso mentre la fase stazionaria precipita nel filtro per formare un letto di fase stazionaria, ricordarsi di non fare MAI andare a secco la fase stazionaria, deve esserci sempre fase mobile, a fine operazione chiudiamo il rubinetto.

Caricamento del campione

Il campione viene caricato con una pipetta goccia a goccia, una volta deposto possiamo aprire il rubinetto e lo chiudiamo una volta che il campione è venuto a contatto con tutta la fase stazionaria.

A questo punto aggiungiamo fase mobile e apriamo il rubinetto nuovamente, all’inizio uscirà solamente fase mobile, quando otterremo i grafico sarà a causa di questa soluzione di sola fase mobile che registreremo 0 di assorbimento.

Eluizione

Durante questa fase i componenti della miscela si muovono lungo la colonna in funzione della loro interazione con la fase stazionaria e con la fase mobile in funzione del Kd.

Per evitare di dover continuare ad aggiungere fase mobile usiamo un reservoir con se possibile una pompa per uniformare il flusso.

Nella eluizione gli analiti si separano, tempo e volume di eluizione sono il tempo impiegato da ciascun analita per uscire dalla colonna e il volume di fase mobile necessario per eluire ciascun analita. Questi due parametri sono collegati dalla relazione:

Ve = te F

Ve= volume di eluizione

te= tempo di eluizione

F= flusso

Possiamo scegliere noi che parametro usare per caratterizzare la soluzione, tanto scelto uno otteniamo facilmente l’altro.

Possiamo usare il volume di eluizione o il numero di provette infatti sono equivalenti, oppure il tempo di eluizione che è collegato.

Possiamo scegliere di effettuare l’eluizione in modi diversi:

1. isocratica: processo di separazione nella colonna che avviene senza che noi modifichiamo la nostra fase mobile o le condizioni di eluizione. 
   
2. non isocratica: lo sviluppo della colonna avviene modificando una o più caratteristiche della fase mobile (come pH o forza ionica)

L’eluizione non isocratica si divide in eluizione in gradiente e eluizione a step, mentre in quest’ultimo in genere è l’operatore a variare il gradiente nel primo tipo, per ottenere un gradiente costante e riproducibile è necessario utilizzare macchinari speciali, questi sono il formatore di gradiente o due pompe. Con questi due accorgimenti le variazioni sono continue e costanti e toccano tutti i punti intermedi del parametro che abbiamo scelto di variare.

Due pompe: da due recipienti preleviamo due fasi mobili differenti e selezionando chee potenza avranno le due pompe potrò variare il gradiente.

Formatore di gradienti:

I due recipienti del formatore di gradienti contengono due soluzioni differenti in termini del parameto che vogliamo variare, sono collegati alla base perchè funionano secondo il principio dei vasi comunicanti* e il secondo, quello collegato con la colonna, è chiamato recipiente di miscelazione (mixing chamber), deve essere sotto costante agitazione (con agitatore meccanico o magnetico) in modo da miscelare opportunamente la soluzione che andrà a costituire la fase mobile.

* Il principio dei vasi comunicanti è il principiofisico secondo il quale un liquido contenuto in due o più contenitori comunicanti tra loro, in presenza di gravità, raggiunge lo stesso livello originando un'unica superficie equipotenziale. In sostanza se 1ml va dal contenitore con Tamp A alla colonna allora 1ml andrà dal contenitore con Tamp B al contenitore Tamp A.

Rivelazione degli analiti

Misuriamo il parametro assorbimento mediante un fotometro ad un’opportuna lunghezza d’onda.

I nostri analiti a fine cromatografia si troveranno nel nostro raccoglitore di frazioni.

Questo è un esempio di come apparirebbe un grafico di eluizione dopo misura dell’assorbimento, notare che viene indicato anche il gradiente di fase mobile se utilizato, l’asse a destra viene sempre utilizzat per questo.

Controllo della purificazione

Se il picco è simmetrico è ragionevole supporre sia composto da una sola proteina però è necessario avere la certezza.

Si effettua il controllo mediante una tecnica analitica come l’elettroforesi, si raccolgono i componenti e si pongono in un gel elettroforetico, vogliamo avere solo una banda perchè è indice di un solo analita, se ne ritroviamo più di una la separazione non ha avuto successo.*

* La proteina potrebbe però avere una struttura quaternaria e averla persa durante la cromatografia dividendosi così nelle sue componenti.